大家好！前段时间跟大家分享了一篇有关细胞免疫荧光实验的操作技巧，（新手细胞免疫荧光实验常见问题解答）今天想和大家分享一下我最近掌握到的一些修饰免疫荧光图片的方法，主要的目的是增加图像的层次感，并且消除荧光强度测量的干扰因素。
任何实验都有很多不可控的因素，就像我之前说的，为了在荧光淬灭严重前拍到好看的图片，我们不能一次性的做很多爬片。但是除了个人操作、抗体选择、细胞生长等自己能够掌握的因素外，倒置荧光显微镜的状态如何是我们不可控的因素。当我们把所有的条件都摸索好，显微镜却想罢工，拍摄的层次不好、对比不够、又或是亮度过高等问题，真的是分分钟想撞墙。神奇的Photoshop软件可以帮助我们在不影响原始数据准确性的情况下对图片进行美化处理。
上述图片是前几天拍摄的CD31免疫荧光照片，从照片中可以看出对比度和亮度较差，并且背景较绿。不管我怎么调整曝光时间和细准焦螺旋都无法保证图片完美的清晰度。最开始我以为是自己的问题，后来问了一下楼里的同学，发现最近大家的荧光照片拍出来都是这个效果，可能是天气太热，机器要罢工了吧。那么，我就用PS美化一下这张图片吧。PS中有一个直方图的功能可以帮助我们了解图像。这里的直方图是表示图像像素点亮度分布的图，并以数据形式表示出来。从曝光的角度来看，直方图可以按照从黑到白不同的明暗程度来统计像素的多少。我们在软件中打开要修改的图片，点击窗口/直方图，就会将直方图显现出来。
在直方图中，横轴代表图像的亮度，从左至右，由黑及白，分为256个级别；纵轴代表的是亮度中的像素数量，左侧代表暗度，右侧代表亮度，也就是说越往左越暗，越往右越亮。如果你的图片亮暗分布合理，直方图中的柱状图就会分布的很均匀。那么像上图中，我的这张直方图波峰集中在最左侧，右侧什么都没有，而且也没有一个缓慢下降的趋势，说明我的这张图缺少亮度，而且这种缺失我们也无法通过软件补回来。这时候我们可以通过软件中的色阶来调整图像。调整色阶其实就是调整了相机记录下的亮度范围，提高对比度，和我上文中说到的软件无法弥补这种缺失并不冲突，这种调整能力远比亮度/对比度的调整更加精确。点击图像/调整/色阶，会弹出一个色阶调整的窗口。
勾选上预览，我们会看到输入色阶下有黑色和灰色两个三角箭头。黑色箭头用来调整整个图像的对比度；灰色箭头用来调整整个图像的亮度。我们首先将黑色箭头移动到第一个峰出现的位置，这时候会看到输入色阶和输出色阶下对应的数值发生了改变，直方图中图像也发生改变，打开的图片的背景绿色明显减少。这项操作其实是将原来图像的亮度从16-255的区间调整到0-255的区间，从而扩大了对比度。
这时候，我们再向左拖动灰色的三角箭头，图像会明显变亮。这个灰色三角箭头调整的是中间值，也就是说控制了整张图片的大部分明暗程度，调整好之后，整个图像也就不那么暗了，对比度也提高了。
（调整前后对比）
最后点击保存，选择需要的保存格式即可。如果不满意调整后的图像，可以直接按下Ctrl+Z回到调整之前的状态，再按下Ctrl+Z还可以回到调整之后的状态，也就是说Ctrl+Z是对比前后调整的快捷键。
上图所示的情况，图片周围的一些细胞染色状态很奇怪，和DAPI染色对比之后发现，周围的杂色很明显是细胞本身状态不好或处于崩解状态的染色情况。因为这张图片的细胞分布比较密集，如果只是截图很难保证只截到想要的部分，那么我们可以先用PS对状态不好的细胞当做杂色处理。点击菜单栏中的滤镜/Camera Raw，快捷键是Shift+Alt+A(这个功能老版本的PS并没有)。在弹出的窗口中，点击细节（三角符号），调节减少杂色中的明亮度和明亮度细节。
调整之后的效果可见周围那些不好的细胞染色已经基本没有了，但是细胞的轮廓变得有些模糊，画面似乎有些失真。如果把这样的图片贴在论文里，那是绝对不行的。接下来，点击菜单栏中的滤镜/锐化/智能锐化，点击放大镜调整到合适的视角，然后调节根据需要调节数量和半径两个参数。数量其实控制的就是锐化的强度，数量越大，图像边缘的颗粒感就越强；半径主要调整的是图像边缘受锐化影响的数量。
这样调整之后可以看到，我们不仅消除了周围的干扰杂色，目标的细胞荧光染色情况在锐化之后图像清晰度有大大增强。这里要注意两点：1、在Camera Raw中，明亮度和明亮度细节上的调节属于细微调节，需要慢慢找到二者的平衡点；2、在智能锐化中也有减少杂色的调节，但是个人建议不要在这里做杂色的相关的处理，这里的杂色针对的主要是图像边缘的杂色，而非整体图像。以上美化图片的方法不仅适用于免疫荧光的图片，电镜、免疫组化等图像都可使用。我们在调整时要注意同一组实验数据调整的参数相同就好了。
上述例子中的两张图片，都有一些很明亮的点，尽管我调整了对比度、亮度以及锐化边缘，都无法去掉。这种情况出现的一般原因：1）外用药物或杂质没有清洗干净，并且与染色结合；2)一抗或二抗没有清洗干净。当然了，我们都希望贴在论文里的图片是完美的，但如果真实实验结果就是如此，我们也只能实事求是。但是这些亮点会影响后续荧光强度的测量，那么我们可以用Image Pro Plus6.0软件解决这个问题。具体测量荧光强度的步骤，我就不一一介绍了，大家应该都会。我们以其中一张图片为例，打开软件后，点击菜单栏下方的count/size；然后点击选色窗口select colors。在HSI的颜色模式下，选择black on transparent；用吸管工具点击图中的想要去除的明亮的点，这种操作可以使过于明亮的杂点变成背景黑色。在这里要注意一下，因为目的蛋白的染色也是绿色，杂点也是过于明亮的绿色，所以在去除的时候很容易将目的蛋白的染色也掩盖了，这一步操作要缓慢耐心进行，首选亮度最大、面积最大的杂点进行处理。如果你的图片杂点过多，很难通过这种操作完全去除杂点干扰，只能说尽量去除。
点击Creat Preview Image，处理好的图片就成形了，之后进行测量即可。
无论是免疫荧光还是免疫组化，这个实验本身只是蛋白实验的辅助证明，即使在SCI投稿时，有些审稿人会让你进行定量分析，但是在使用软件进行强度测量时，都一定会存在主观因素的影响。所以还是那句话，尽量在前期操作过程中减少干扰因素，后期美化和分析图片的时候要保证设置的参数一致。
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